Actividad antifúngica del extracto alcohólico de Citrus x paradisi (Pomelo) y Cestrum nocturnum (Huele de noche) contra Geotrichum spp., Aspergillus niger y Rhizopus spp.

*Diego Martínez Gil, **José Fernando Fuentes Gutiérrez, **a.Gabriel Martínez González.

Trabajo científico

RESUMEN

En los últimos años se ha observado un aumento de la incidencia de infecciones por hongos filamentosos como Aspergillus, que han contribuido a un aumento de las tasas de morbilidad y de mortalidad de las infecciones fúngicas invasoras, sobre todo en pacientes inmunocomprometidos.

La medicina tradicional ha cobrado importancia como terapia alternativa al uso de medicamentos sintéticos producidos en la industria farmacéutica. En este proyecto se empleó un extracto alcohólico de Cestrum nocturnum y Pomelo a concentraciones de 250-750 mg/mL y 100-700 mg/mL, respectivamente. Se utilizó como control positivo fluconazol, itraconazol, ketoconazol y anfotericina B, a una concentración de 50 µg/ml. La actividad antifúngica se evaluó utilizando el método de difusión en disco. De los resultados obtenidos, presento actividad antifúngica el extracto de C. nocturnum contra Geotrichum spp con halos de inhibición de 12.78 a 15.64 mm.

Palabras clave: Medicina tradicional, actividad antifúngica, C. nocturnum, Pomelo.

ABSTRACT

In recent years, there has been an increased incidence of filamentous fungal infections such as Aspergillus, which have contributed to an increase in morbidity and mortality rates of invasive fungal infections, especially in patients Immunocompromised. Traditional medicine has become important as an alternative therapy to the use of synthetic drugs produced in the pharmaceutical industry. This project used an alcoholic extract of Cestrum nocturnum and Grapefruit at concentrations of 250-750 mg/mL and 100-700 mg/mL, respectively. It was used as a positive control fluconazole, itraconazole, ketoconazole and amphotericin B, at a concentration of 50 g/ml. Antifungal activity was evaluated using the disccasting method. From the results obtained, I present antifungal activity the extract of C. nocturnum against Geotrichum spp with inhibition halos of 12.78 to 15.64 mm.
Keywords: Traditional medicine, antifungal activity, C. nocturnum, Grapefruit.

INTRODUCCIÓN

Las micosis son infecciones causadas por hongos, se han clasificado teniendo en cuenta la localización anatómica: superficiales o cutáneas, subcutáneas y profundas, sistémicas o invasoras.

Las infecciones fúngicas invasoras (IFI) son micosis de tipo oportunista que en su mayoría afectan a pacientes inmunocomprometidos (personas con el sistema de defensa deprimido), son una causa frecuente de mortalidad y morbilidad.

En México son pocos los estudios relacionados con epidemiología en IFI, debido a la dificultad para aislar e identificar el agente etiológico y para diferenciar entre colonización e infección en casos de IFI, dado que hay poco personal capacitado y con experiencia en el área de Micología médica. Estudios realizados por el instituto nacional de cancerología reportan una mortalidad cercana al 54% en personas afectadas por especies de Candida y 61% por infecciones debidas a otros hongos, como Rhizopus, Cryptococcus neoformans, Geotrichum candidum, Fusarium solani y Trichosporon beigelii. Algunos estudios europeos revelan que el 43% de las IFI son ocasionadas por Aspergillus spp., seguidas de un 28% por Candida spp. y un 8% por otros hongos ambientales, esto revela la importancia de realizar estudios en epidemiología en México (Guevara et al., 2013).

Aspergillus es un patógeno oportunista que causa infecciones locales y superficiales como las micosis (otomicosis, onicomicosis, queratitis) y el Aspergiloma o bola fúngica que se desarrolla en una cavidad como en una lesión pulmonar, producida por una enfermedad pulmonar previa o en un seno nasal. En individuos con el sistema inmunitario debilitado, pueden producir infecciones invasivas, como la Aspergilosis invasiva diseminada que cursa de forma grave con neumonía, afectando al pulmón y pudiéndose diseminar a otros órganos (Abarca, 2000).

Geotrichum es una infección oportunista causada por el hongo Geotrichum candidum, que produce lesiones broncopulmonares, bronquiales, bucales, vaginales, cutáneas y diseminadas. Dado que Geotrichum en un habitante habitual del tracto intestinal, puede causar infecciones oportunistas de origen endógeno o de origen exógeno adquiridas vía ingestión o inhalación en pacientes diabéticos, tratados con antibióticos, corticoides, citostáticos, inmunosupresores, pacientes neutropénicos, con cáncer, VIH (Kurtzman & Fell, 1998).

Rhizopus se clasifica en el orden Mucorales. La mayoría de los casos se presenta en personas con factores de oportunismo severos como Diabetes Mellitus descompensada, leucemia, o cáncer. Las infecciones generalmente se adquieren por vía respiratoria ya que las esporas de los hongos se encuentran en el ambiente, aunque en las formas cutáneas primarias, la infección se adquiere por solución de continuidad (Pérez, 2002).

La medicina tradicional, en los últimos años ha cobrado importancia como terapia alternativa al uso de medicamentos sintéticos producidos en la industria farmacéutica que están generando resistencia antimicrobiana, razón por la cual se está procurando investigar nuevos agentes antifúngicos más potentes y sobre todos seguros, como es el caso de Pomelo y Cestrum nocturnum (Wen et al., 2011).

En la literatura, se reporta que el extracto de Cestrum nocturnum posee efectos curativos en enfermedades de la piel, presenta actividad cardiotónica, hipotensora y estimulante respiratorio, abortiva, dispépsica, fungicida, antiespasmódica, diurética, herbicida, antiviral entre otras (Cáceres et al., 1987). Por otra parte, algunos autores indican que estas plantas presentan sustancias farmacológicamente activas como saponinas, alcaloides, ácidos grasos, aceites esenciales, fenoles, entre otros (Bouchbaver et al., 1995).

Las plantas del género Citrus principalmente el Pomelo han sido muy estudiadas para el control de microorganismos, encontrando que inhiben el crecimiento de varias especies de hongos. Esto se debe a que producen varios metabolitos secundarios en los frutos y hojas, incluyendo, terpenos, fenoles, flavonoides y cumarinas (Okwu et al., 2007).

MATERIAL Y MÉTODO

Material vegetal y obtención de extractos.

Para los ensayos se utilizaron hojas de Cestrum nocturnum (C. nocturnum), que fue recolectada en el municipio de Ixtlahuaca y cáscaras de toronja. La identificación taxonómica de Cestrum nocturnum fue realizada en el Herbario FES-Iztacala UNAM.

Los extractos metanólicos de las hojas de Cestrum nocturnum y la cáscara de toronja se obtuvieron mediante maceración, en el cual se colocaron dos frascos de vidrio ámbar con 40 g de hojas en 250 ml y 400g de cáscaras en 640 mL de metanol (HYCEL). Ambos frascos se cubrieron de la luz y se dejaron reposar durante 15 días a temperatura ambiente en un lugar fresco y seco, con agitación dos veces por semana.

Transcurrido el tiempo de maceración se filtró el líquido y se desecharon las hojas y cáscaras y se evaporó el filtrado a presión reducida en el rotavapor (Hanh Shin Scientific, HS-2000 NS).

Identificación de metabolitos

Para determinar la presencia de metabolitos secundarios presentes en los extractos se utilizaron las siguientes pruebas: Determinación de alcaloides (Dragendorf-Bilbao, 1997), determinación de flavonoides (Shinoda-Martínez, 2005), determinación de compuestos fenólicos (Cloruro férrico-Espinosa et al., 2015), determinación de saponinas por espuma (Bilbao, 1997), determinación de terpenos (Rivas-Morales, 2016) y determinación de cumarinas (Rivas-Morales, 2016).

Actividad antibacteriana por el método de difusión en disco

Las cepas de hongos utilizadas Geotrichum spp, Rhizopus spp y Aspergillus niger se tomaron del cepario del laboratorio de Microbiología-QFB de la Universidad de Ixtlahuaca, se resembraron en tubos de agar Papa Dextrosa con la técnica de picadura y se dejaron incubando entre 2 a 5 días a una temperatura de 25ºC ± 2 ºC.

Con los extractos obtenidos se realizaron concentraciones de C. nocturnum a 250, 500 y 750 mg/mL y 50, 100, 300, 500 y 700 mg/mL de Citrus x paradisi, todos disueltos en Dimetilsufóxido (DMSO) (EMSURE ACS) y se depositaron cado uno en tubos eppendorf estériles. Con ayuda de unas pinzas estériles, se dispersaron en partes iguales discos estériles (Whatman) grado AA, sobre la superficie de una placa de Agar Papa Dextrosa, a cada disco estéril se colocaron lentamente 8 µL de la concentración del extracto a evaluar. Por último, se realizó la técnica de siembra micológica por picadura en el centro de la caja petri. Se dejó reposar de 5 min para lograr la absorción total del disco. Las cajas petri incubaron a una temperatura entre 25ºC ± 2ºC por 72h y se midió el halo de inhibición formados con ayuda de un vernier (cada análisis se realizó por triplicado). Los resultados obtenidos se analizaron en base al programa estadístico SPSS por medio de una prueba ANOVA (análisis de varianza), comparación de medias de Tukey, p<0.05.

Se emplearon como control positivo Fluconazol, Itraconazol, Ketokonazol y Anforeticina B (como forma farmacéutica) a una concentración de 50 µg/ml y como control negativo DMSO al 5% (la prueba se realizó por triplicado).

RESULTADOS

El análisis de identificación taxonómica de la planta se llevó a cabo en el Herbario FES-Iztacala UNAM con el número de registro 2715 IZTA.

El extracto obtenido de Cestrum nocturnum fue un aceite de color verde obscuro, con una consistencia viscosa. El extracto de Pomelo fue un aceite de color naranja claro.

Se determinó que el extracto metanólico de Cestrum nocturnum está compuesto por metabolitos secundarios tales como: Alcaloides, Flavonoides, Fenoles y saponinas; por otro lado el extracto metanólico de Pomelo está compuesto por metabolitos secundarios tales como: Flavonoides, Fenoles, Terpenos, Cumarinas.

Los antimicóticos que se emplearon como control positivo para Aspergillus niger, Rhizopus spp., Geotrichum spp, fueron resistentes para las 3 cepas empleadas (Aspergillus niger, Rhizopus spp., Geotrichum spp).

En la tabla 1 y figura 1 se muestra la actividad antifúngica del extracto metanólico de Cestrum nocturnum a diferentes concentraciones contra Geotrichum spp, mostrando crecimiento a las 36 hrs. No encontrando actividad biológica con el extracto de Pomelo.

Tabla 1. Actividad antifúngica del extracto metanólico de Cestrum nocturnum contra Geotrichum spp.

Figura 1. Se muestra la caja petri al derecho y al reverso de Geotrichum spp., con halos de inhibición, con extracto de Cestrum nocturnum a concentraciones de 250, 500, 750 mg/ml, sembrado por picadura, (se realizó por triplicado) (Fuente: propia).

De los demás resultados no se encontró actividad antifúngica del extracto metanólico de Cestrum nocturnum y Pomelo contra Aspergillus niger y Rhizopus spp.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En nuestro país son pocos los estudios relacionados con epidemiología en IFI, debido a la dificultad para aislar e identificar el agente etiológico y para diferenciar entre colonización e infección en casos de IFI, dado que hay poco personal capacitado y con experiencia en el área de Micología médica. Estudios realizados por el instituto nacional de cancerología reportan una mortalidad cercana al 54% en personas afectadas por especies de Candida y 61% por infecciones debidas a otros hongos, como Rhizopus, Cryptococcus neoformans, Geotrichum candidum, Fusarium solani y Trichosporon beigelii. Un estudio realizado por Guevara y colaboradores en el año 2013, determinaron que el 43% de las IFI son ocasionadas por Aspergillus spp., seguidas de un 28% por Candida spp. y un 8% por otros hongos ambientales, esto revela la importancia de realizar estudios en epidemiología en nuestro país.

El aumento en la prevalencia de las micosis, la aparición de cepas fúngicas resistentes a los agentes antimicóticos empleados en la actualidad y los efectos secundarios que estos provocan en los pacientes son, sin duda, algunos indicadores de la necesidad de encontrar o desarrollar nuevos productos naturales que produzcan menor toxicidad, resistencia y reacciones adversas que los fármacos tradicionales, además de estar al alcance de las clases más populares tal como lo establece Guevara et. al., 2013 y Churata en 2016.

Cestrum nocturnum es una planta ornamental, endémica; esta planta se recolectó en el municipio de Ixtlahuaca, Estado de México; estudios realizados por Backhouse indica que en México se le da un uso ornamental pero en otros países se emplea en varias aplicaciones de la medicina popular, los chinos utilizan hojas de Cestrum nocturnum por su importancia farmacológica en quemaduras e hinchazones, entre otros usos. Un estudio realizado por Grainge & Ahmed en 1988 clasifican a esta planta dentro del grupo fungicida. En este estudio se trabajó con hojas de Cestrum nocturnum debido a los estudios realizados por Domínguez en 1973 mencionan que se encuentran metabolitos en las hojas que producen un efecto antifúngico.

Mientras que Pomelo es un cítrico que tiene propiedades medicinales; este cítrico fue comprado en el mercado 1º de septiembre ubicado en el municipio de Ixtlahuaca, Estado de México, se han encontrado varias sustancias de su composición con propiedades antifúngicas, antiinflamatorias, antioxidantes, antivirales, como lo determinaron estudios de Churata en 2016, Koul et al., 2018 y Viuda en 2007, razón por la cual se han empleado para fabricar varios productos comerciales de Pomelo.

La identificación taxonómica de Cestrum nocturnum fue realizada en el Herbario FES-Iztacala UNAM, en el cual corrobora que se está trabajando con la planta recolectada.

Para la extracción de los metabolitos se utilizó el método de maceración empleando metanol, tomando en consideración el estudio de Bautista-Baños et al., 2008, que encontró que el extracto metanólico puede extraer mejor los compuestos con actividad antifúngica, además.

Cvetnic & Vladimir-Knezevic, en 2004 evaluaron la actividad antifúngica del extracto metanólico de cáscara de toronja sobre diferentes cepas de hongos, determinando que el extracto demostró actividad antifúngica en las concentraciones desde 8,25 % a 16,50 % y el estudio realizado por Torres et al., 2013 determinaron que el extracto metanólico contiene diferentes metabolitos tales como flavonoides y cumarinas.

Las pruebas fitoquímicas, que se realizaron ayudaron a determinar que en los extractos de Cestrum nocturnum se encontraban flavonoides, compuestos fenólicos, saponinas y alcaloides, por otro lado en extractos de Pomelo se encontraban compuestos terpénicos, fenólicos, flavonoides y cumarinas. Los metabolitos secundarios encontrados en las hojas de Cestrum nocturnum se les atribuye características antifúngicas, según Mimaki et al., 2001; los compuestos aromáticos, saponinas y flavonoides de C. nocturnum pueden estar ejerciendo la actividad antifúngica aquí reportada. Sharma & Sharma (2010) investigó las propiedades fitoquímicas de Pomelo mostrando la presencia de metabolitos tales como: Terpenos, flavonoides, Fenoles, esteroides, Cumarinas y glucósidos. (Churata, 2016).

Los mecanismos de acción de los metabolitos secundarios contra las cepas empleadas (Geotrichum spp., Aspergillus niger y Rhizopus spp.) en el mayor de los casos afectan la integridad de la membrana de células antifúngicas tal es el caso de las saponinas (Rivas-Morales et al, 2016).

En el caso de los alcaloides presentes pueden ocasionar modificaciones del ADN-ARN (mutaciones), inhibición de la traducción proteica, se ha observado que afectan las membranas dando efectos negativos en los transportadores de iones y por efecto en la estabilidad de la membrana, además cuentan con inhibición enzimática de hidrolasas y adenilatociclasa (Rivas-Morales et al, 2016; Ávalos & Pérez-Urria, 2009).

Los resultados de actividad antifúngica se analizaron en base al programa estadístico SPSS por medio de una prueba ANOVA (Análisis de varianza), comparación de medias de Tukey; cada ensayo se realizó por triplicado.

De acuerdo a Bernal y colaboradores, (2010) los tratamientos de Cestrum nocturnum a 50% y 100% inhiben la actividad micelial y el proceso de esporulación de los hongos (Geotrichum spp., Rhizopus spp. y Aspergillus niger) teniendo un comportamiento inhibitorio semejante al del Ketoconazol 200 mg, estudios de Barrera-Necha & Bautista-Baños en 2008, demostraron que los extractos metanólicos tienen efectos estadísticamente significativos a dosis de 5 y 10 mg/ml sobre Geotrichum spp, mostrando un halo de inhibición entre 15-20 mm, en consideración a estos estudios los extractos metanólicos de Cestrum nocturnum empleados tuvieron actividad antifúngica contra Geotrichum spp., con un halo de inhibición de 15.64±0.56 mm a una concentración de 750 mg/ml por otro lado los extractos metanólicos de Cestrum nocturnum no tuvieron actividad antifúngica contra Aspergills niger y Rhizopus spp.

El estudio realizado por Vargas et al., 1997, llega a la conclusión que los extractos de Pomelo no muestra inhibición antifúngica micelial ante hongos patógenos, designando que a la fecha existan variantes de estos hongos que ya hayan desarrollado algún grado de resistencia ante el extracto en consideración de los estudios realizados los resultados de los extractos metanólicos de Pomelo empleados no tuvieron actividad antifúngica con ninguna de las cepas empleadas (Geotrichum spp., Aspergillus niger, Rhizopus spp.).

Cabe resaltar que los controles positivos empleados (Anfotericina B, Itraconazol, Ketoconazol y Fluconazol) no tuvieron ninguna actividad ante las cepas empleadas (Geotrichum spp, Aspergillus niger y Rhizopus spp.).

Conclusión

El extracto metanólico de Cestrum nocturnum mostró efecto antifúngico, inhibiendo el crecimiento de Geotrichum spp. Por otro lado las cepas de Rhizopus spp y Aspergillus niger presentaron resietencia contra el extracto de Cestrum nocturnum.

El extracto metanólico de Pomelo no mostro efecto antifúngico contra Geotrichum spp., Rhizopus spp., y Aspergillus niger.

En las hojas de Cestrum nocturnum se determinó la presencia de saponinas, alcaloides, compuestos fenólicos y flavonoides a los cuales se les pudiera atribuir el efecto antifúngico.

En la cáscara de Pomelo se determinó la presencia de flavonoides, cumarinas y compuestos fenólicos, los cuales están reportados como metabolitos con actividad antifúngico.

*Alumno egresado de la Licenciatura en Química Farmacéutica Biológica-UICUI.

** Docentes de la Universidad de Ixtlahuaca CUI, Licenciatura en Química Farmacéutica Biológica.

**a. Autor de correspondencia: M en C. Gabriel Martínez González. Correo: gabriel.martinez@uicui.edu.mx.

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